سامانه خدمات پزشکی و سلامت آترینا

ژن متالو- β -لاکتاماز NDM-1 با طیف گسترده و کارباپنم فعال به سرعت در حال گسترش هستند. ما ژنوم کامل Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-2146 را که اولین جداسازی ایالات متحده برای رمزگذاری NDM-1 است، ارائه می دهیم و مجموعه ای از ژن ها و جهش های مقاوم به آنتی بیوتیک آن، از جمله ژن های هشت لاکتاماز β و 15 آنزیم مقاوم به آنتی بیوتیکی دیگر را توصیف می کنیم. برای روشن کردن روند تکامل این مجموعه غنی ، عناصر متحرک ژنوم از جمله چهار پلاسمید با درجات مختلف حفاظت و بافت پارچین و یازده جزیره ژنومی کروموزومی مشخص شد. جزیره ای با رویکرد فیلوژنومی جدید شناسایی شد ، که بیشتر نشان دهنده جایگاه سنتز پلی ساکارید cps-lps است، جایی که انتقال و همجوشی اُپرون مشخص شد. بخش های منحصر به فرد پلاسمید و اتصالات موزاییکی مشخص شد. blaCTX-M-15 منتقل شده توسط پلاسمید اخیراً توسط ISEcp1 به کروموزوم منتقل شد. هیچ یک از یازده نسخه کامل IS26 ، متداول ترین عنصر IS در ژنوم ، تکرار مستقیم 8 جفت باز مورد انتظار از توالی هدف یکپارچه را نداشته است ، که حاکی از آن است که هر نسخه پس از آخرین رویداد جابجایی، تحت یک بازترکیبی مشابه قرار گرفته است. تجزیه و تحلیل مقایسه ای نیز IS26 را به عنوان یک اتصال بازترکیبی مکرر بین اجداد پلاسمید و همچنین جایگاه رزولواز را نشان می دهد. در استفاده جدید از درون جای دهی پربا، زیرجمعیت هایی نوترکیب مشابه از کشت باکتریایی تشخیص داده شد. دراستفاده دوم، واسطه های جابجایی دایره ای برای توالی درون جای دهی جدید ISKpn21 از خانواده ISNCY تشخیص داده شد ، که نشان می دهد از مکانیزم جابجایی دو مرحله ای IS3 استفاده می کند. فیلوژنی مبتنی بر ژنوم مقاوم نشان داد که یک خوشه کلبسیلا یکپارچه حاوی Enterobacter aerogenes و Raoultella است که نشان می دهد نوع دوم باید متوقف شود.

کارباپنم ها یکی از معدود ضد میکروب هایی هستند که در برابر باکتری های مقاوم به چند دارو موثر هستند، اما با ظهور انتروباکتریاسه مقاوم در برابر کارباپنم (CRE)، استفاده از آنها کمتر می شود. کلبسیلا پنومونیه شایعترین گونه CRE در ایالات متحده است ، که به طور معمول به صورت یک عفونت اکتسابی در بیمارستان با مرگ و میر بالا ظاهر شده و تقریباً به تمام آنتی بیوتیک های موجود مقاوم است [1-4]. آنزیم هایی که کارباپنم را غیرفعال می کنند مکانیزم اصلی مقاومت هستند. سرین β لاکتاماز KPC که از سال 2001 شناخته شده است، رایج ترین نوع کارباپنم در ایالات متحده آمریکا و سایر کشورهاست. بیشتر نگرانی های اخیر بابت متالو β لاکتاماز NDM_1 فعال به کارباپنم است که نخستین بار از سال 2008 در جداسازی K. pneumonia تعریف گردید. blaNDM-1 به طور قابل توجهی در پلاسمیدهای بزرگ پیوندی همراه با دیگرعوامل تعیین کننده مقاوم به آنتی بیوتیک یافت می شوند. ناحیه ی ژن در برخی شرایط تکرارهای متوالی را شکل دهد که شماره نسخه را بالا می برد. گسترش اخیر blaNDM-1 هم در گونه ها و هم درمیان ناحیه جغرافیایی بزرگ، چشم گیر و مستند است.
مکانیزم های غیر کارباپنمیِ مقاومت کارباپنم نیز شناسایی شده اند که شامل افزایش فعالیت پمپ جریان و تغییر مشخصات غشای پورین بیرونی می شود که دسترسی کارباپنم به دیواره ی سلول را کنترل می کند.

سویه ی ATCC BAA-2146 (Kpn2146) K. pneumonia اولین جداسازی در ایالات متحده است که برای رمزگذاری NDM-1 به اضافه ی طیف گسترده ای از دیگرعوامل تعیین کننده مقاوم به آنتی بیوتیک یافت شد. آزمایش حساسیت انجام شده در ATCC نشان داد که Kpn2146 در برابر هر یک از 34 ترکیب ضد میکروبی و ضد میکروبی / بازدارنده آزمایش شده مقاوم است. در حالی که ژنهای مقاوم به Kpn2146 توسط ریزآرایه [15] و توالی یابی ژنوم (ناقص) [16،17] مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته اند ، اما هیچ یک از این دو روش به طور کامل مشخص کننده مجموعه ژن مقاومت آنتی بیوتیکی پیچیده Kpn2146 نیست. به عنوان مثال برخی از ژن های مقاوم به آنتی بیوتیک Kpn2146 که در کار قبلی شناخته نشده بودند و ژن های تکثیر شده فقط یک بار توسط ریزآرایه و در یک کانتیگ در ژنوم ناقص شمارش شدند. حتی هنگامی که یک ژنوم ناقص لیست کامل ژن ها را ارائه می دهد، این سوال که چگونه یک عامل بیماری زا چنین مجموعه های بزرگی از ژن های مقاوم را جمع می کند، به اطلاعات زمینه ای برگرفته از تکمیل ژنوم نیاز دارد. ژنوم کامل باید وقایع تکثیر ژن را آشکار کند، تا محل پلاسمید را در مقابل ژن کروموزومی تعیین نماید و از روشهای فیلوژنومی برای درک تکامل ژنوم استفاده کند. در این مطالعه، ژنوم تکمیل شده ی Kpn2146 را ارائه داده، چهار پلاسمید را شناسایی نموده و امکان بررسی دقیق عوامل تعیین کننده مقاوم به آنتی بیوتیکی آن را ارائه می دهیم که مشخصات مقاومت آن را به طور کامل توضیح می دهد. این عوامل تعیین کننده شامل 23 ژن اصلی از طریق پلاسمید است که آنزیم های مقاوم به آنتی بیوتیک را رمزگذاری می کنند ، که هشت ژن از آنها ژن b-lactamase هستند. درک چگونگی پدید آمدن چنین عوامل بیماری زای بسیار غنی، که نیاز به تجزیه و تحلیل کسر متحرک ژنوم دارد، بسیار مهم است. بر این اساس ، ما جزیره های ژنومی موجود در کروموزوم، بافت پارچین در پلاسمیدها و عناصر قابل انتقال در کل ژنوم را بررسی کردیم.

آماده سازی و توالی DNA
Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-2146 (Kpn2146) در سال 2010 از ادرار یک بیمار بیمارستان ایالات متحده که اخیراً در هند تحت مراقبت های پزشکی قرار گرفته بود جدا شد [14]. DNA ژنومی از مجموعه American Type Culture (ATCC) به دست آمد و در آب مجدداً معلق گردید. مجموعه داده توالی ژنومی جفت شده Illumina که قبلاً شرح داده شد، از یک اجرای MiSeq، پس از اصلاح کیفیت و توالی آماده ساز، شامل 3،023،757 جفت های خوانشی، با میانگین خواندن 88.3 جفت باز می شود [17]. مجموعه ای از توالی های Biosciences Pacific (PacBio) از DNA ژنومی mg 2 در مرکز تعیین توالی ژن Yale تولید شد که آماده سازی قالب 5 کیلو بایت را انجام داد و مخزن را روی دو سلول SMRT توالی داد و 88،073 خوانش مستقیم و 1744 توالی توافقی دایره ای را ارائه داد (توزیع اندازه : میانگین 2408 ؛ متوسط 1948 ؛ محدوده 50-18951 ؛ N50 3254 جفت باز).